seurat_on_seekspace

背景信息¶

本⽂档是关于寻因SeekSpace技术所得到的数据及其分析⽅法的说明。
寻因SeekSpace技术可以检测到单细胞精度的基因表达数据，同时也能定位出每个细胞在组织中的空间坐标。
SeekSpace的数据分析简便易学，能够很方便地兼容常见单细胞转录组的分析软件，例如seurat和scanpy。
本数据为基于SeekSpace技术的⼩⿏（8周龄）脑的空间数据。数据中包含9,333个细胞的单细胞转录组矩阵，空间坐标矩阵和组织DAPI染⾊图⽚。

⽂件说明¶

SeekSpace技术的配套的基础数据处理的软件是SeekSpace tools，该软件可以从测序文库中识别细胞的表达信息，同时可以识别出每个细胞在空间上的位置。
经过SeekSpace tools软件处理之后所得到的结果文件格式如下：

├── filtered_feature_bc_matrix # 表达矩阵⽬录，可以使⽤seurat的Read10X命令进⾏读取
│ ├── barcodes.tsv.gz
│ ├── features.tsv.gz
│ └── matrix.mtx.gz
├── mouse_brain_aligned_cropped.png # 为⼩⿏脑组织切⽚的DAPI染⾊图⽚
├── seurat.ipynb # 为使⽤seurat分析该⼩⿏脑空间数据的jupyter示例⽂件
└── spatial_matrix.csv # 为⼩⿏脑测序数据中细胞的空间坐标⽂件。第1列是barcode，顺序与

matrix中的filtered_feature_bc_matrix/barcode中细胞的顺序⼀致；第2列和第3列分别为该barcode所代表的细胞的空间位置（即空间芯⽚上的像素坐标）。
SeekSpace技术中一个像素点的大小是约为 0.2653 微米，将像素点的坐标乘以 0.2653 即可转换计算细胞在真实空间上的距离。

分析⽅法¶

这⾥以seurat软件为例，来介绍SeekSpace数据的分析。
具体步骤如下：
第⼀步，读取SeekSpace的矩阵⽂件，并聚类。
（这⾥的代码可以根据⾃⼰的⽬的进⾏修改，只要是符合seurat分析单细胞转录组的要求即可。）

library(Seurat)
library(dplyr)
library(base64enc)

创建seurat obj¶

这里直接使用seurat常用的读入和创建矩阵的方法即可。

mouse_brain.data <- Read10X('./filtered_feature_bc_matrix')
mouse_brain <- CreateSeuratObject(counts=mouse_brain.data,project='mouse_brain')

聚类¶

这里使用常见的默认参数进行降维聚类，实际分析的时候，可以按照样品的特征进行相应的修改。

mouse_brain <- NormalizeData(mouse_brain, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000) %>%
FindVariableFeatures(selection.method = "vst", nfeatures = 2000) %>%
ScaleData() %>%
RunPCA() %>%
FindNeighbors(dims = 1:30) %>%
FindClusters(resolution = 0.8) %>%
RunUMAP(dims = 1:30)

添加空间坐标¶

接下来我们使用seurat的CreateDimReducObject函数，给seurat对象中的每个细胞添加一个空间的坐标。
注意！！
CreateDimReducObject函数读入空间坐标矩阵的细胞的顺序必须与mouse_brain里面的meta.data里面细胞的顺序相一致，否则在多样品整合分析的时候会出现细胞顺序错乱的情况。
这里我们使用了一个简单的一行代码对空间坐标矩阵进行了排序。

spatial_df <- read.csv('./spatial_matrix.csv', row.names = 1)
spatial_matrix <- as.matrix(spatial_df)
spatial_matrix_sorted <- spatial_matrix[match(row.names(mouse_brain@meta.data),row.names(spatial_matrix)), ]
mouse_brain@reductions$spatial <- CreateDimReducObject(embeddings = spatial_matrix_sorted, key='spatial_', assay='RNA')

经过这步处理之后，我们可以在seurat对象中看到一个新的坐标系”spatial“，这个坐标系即为每个细胞在空间位置上的坐标。

细胞注释结果¶

接下来我们再把细胞的注释结果添加到每个细胞上，这样我们就可以看不同的细胞类型在空间上的分布情况了。
SeekSpace细胞注释的过程，跟普通的单细胞注释的过程完全一致。
我们之前已经对demo数据进行了大群和亚群的注释，注释的结果文件放在了anntation.csv文件中。
接下来我们简单的读入处理一下。

anno <- read.csv("./annotation.csv",row.names = 1,header = TRUE)
mouse_brain$cell_bc <- row.names(mouse_brain@meta.data)
mouse_brain@meta.data <- left_join(mouse_brain@meta.data,anno,by = "cell_bc")
row.names(mouse_brain@meta.data) <- mouse_brain$cell_bc
mouse_brain %>% head

A data.frame: 10 × 8
	orig.ident	nCount_RNA	nFeature_RNA	RNA_snn_res.0.8	seurat_clusters	cell_bc	Main.CellType	subcluster
	<fct>	<dbl>	<int>	<fct>	<fct>	<chr>	<chr>	<chr>
AAACCCATACATAGTGT	mouse_brain	3185	1660	3	3	AAACCCATACATAGTGT	Oligo	Oligo_2
AAACCCATACCGCTTCG	mouse_brain	10962	3603	9	9	AAACCCATACCGCTTCG	Ext	Ext_L56
AAACCCATACGCTCTAT	mouse_brain	1695	988	2	2	AAACCCATACGCTCTAT	Ext	Ext_L23
AAACCCATACTCATAGA	mouse_brain	1303	867	6	6	AAACCCATACTCATAGA	Ext	Ext_L56
AAACCCATACAAGCCTG	mouse_brain	16009	4551	13	13	AAACCCATACAAGCCTG	Ext	Ext_L5_2
AAACCCATACATTCGAA	mouse_brain	17436	4947	9	9	AAACCCATACATTCGAA	Ext	Ext_L56
AAACCCATACCTAGCCT	mouse_brain	16651	4843	6	6	AAACCCATACCTAGCCT	OPC	OPC_2
AAACCCATACGGCTGTG	mouse_brain	2876	1639	17	17	AAACCCATACGGCTGTG	Inh	Inh_6
AAACCCATACTCTCCTC	mouse_brain	2255	1225	1	1	AAACCCATACTCTCCTC	Ext	Ext_Unk_3
AAACCCATACACCAGCA	mouse_brain	7682	2997	6	6	AAACCCATACACCAGCA	Ext	Ext_L56

我们可以继续使用seurat包默认的一系列函数进行绘图

我们先绘制一些较为常见的图形，比如降维聚类图和基因表达的图。

DimPlot(mouse_brain) + DimPlot(mouse_brain, group.by = "Main.CellType")

FeaturePlot(mouse_brain, reduction = 'umap', features=c('Mbp','Mobp', 'Olig1','Plp1'), pt.size = 1)

Seekspace数据使用说明¶